Faculteit BIW > Doctorandi > Archief doctoraatsaankondigingen > Doctorandus Stijn MERTENS

Stijn MERTENS

Enriching Aromatic Diversity of Lager Beers via Interspecific Yeast Breeding and CRISPR-Cas9 Editing

dinsdag 15 januari 2019 om 17.00 uur
Promotiezaal, 01.46, Universiteitshal, Naamsestraat 22, 3000 Leuven

Wetenschappelijke context van het proefschrift

Bier is de gefermenteerde drank bij uitstek en is op wereldgebied, met een jaarlijkse productie van meer dan 1.96 miljard hectoliter, de derde meest geconsumeerde drank (na water en thee). Traditioneel bestaan er twee soorten bier; namelijk bieren van hoge (‘ale’)- en lage (‘lager’) gisting (meestal pils-type bieren).

Pilsbieren, dewelke instaan voor 90% van de totale wereldwijde bierproductie, worden exclusief gebrouwen met de pilsbiergist Saccharomyces pastorianus. S. pastorianus is geen pure gistsoort, maar is het resultaat van een interspecifieke kruising tussen enerzijds de alom bekende brouwers en bakkers gist S. cerevisiae en anderzijds een koude tolerante en wilde gist S. eubayanus. De gelimiteerde genetische diversiteit binnen pilsbiergisten reflecteert zich in de gelimiteerde invloed van deze gisten op de smaak en aroma van pilsbieren, zeker wanneer men dit vergelijkt met de overweldigende diversiteit aan bovengistingsbieren.

Desondanks het feit dat het succes van pilsbieren grotendeels te danken is aan de typerende frisse smaak en hoge drinkbaarheid, wordt differentiatie en diversiteit steeds belangrijker, dit om tegemoet te komen aan de dalende consumptie van pilsbieren, en de verandering van een meer globale biermarkt, naar een niche-gedreven markt. De ontwikkeling van nieuwe pilsbiergisten kan helpen om een nieuw type bier te ontwikkelen, dat de verbinding maakt tussen enerzijds de diverse en aromatische bovengistingsbieren en anderzijds de frisse en vlot drinkende pilsbieren.

Hiertoe werd er een ‘spore-to-spore’ kruisingstechniek toegepast om zes specifiek geselecteerde S. cerevisiae gisten te kruisen met twee verschillende S. eubayanus gisten. Een representatieve set van 31 nieuwe interspecifieke hybride-gisten werd vervolgens getest voor hun temperatuurtolerantie, alsook hun fermentatiecapaciteit en aromaproductie in laboschaal en (voor sommigen) pilootschaal pilsbierfermentaties. Algemeen vertoonden de ontwikkelde interspecifieke gisthybriden een significant betere groei bij lage temperaturen (4°C tot 16°C) in vergelijking met hun respectievelijke S. cerevisiae ouderstammen, alsook een significant betere groei bij hoge temperaturen (30°C tot 37°C) in vergelijking met hun respectievelijke S. eubayanus ouders. Ten eerste, zorgde de verbrede temperatuurtolerantie van de nieuwe gisthybriden voor een competitief voordeel in fermentaties bij koudere temperaturen ten opzichte van hun S. cerevisiae ouderstammen. Daarenboven, onderstrepen deze resultaten de capaciteit van interspecifieke hybriden om eigenschappen van de twee verschillende oudersoorten te combineren in één nieuw gegenereerd micro-organisme. Naast de verbrede temperatuurtolerantie, vertoonden de meeste nieuw gegenereerde interspecifieke gisthybriden een beterde fermentatiecapaciteit in vergelijking met beide ouderstammen in labo- en piloot-schaal pilsbierfermentaties, uitgevoerd bij respectievelijk 16°C en 12°C. Sommige nieuwe interspecifieke gisten produceerden zelfs gelijkaardige ethanolconcentraties dan de huidige commercieel toegepaste pilsbiergisten. De aromaproductie van de gegenereerde interspecifieke gisthybriden verschilde tevens significant van de aromaproductie van de huidige, commercieel toegepaste pilsbiergisten, wat het potentieel van deze nieuwe hybridegisten onderlijnt voor de productie van nieuwe biertypes, die het vacuüm tussen de goed drinkbare, frisse pilsbieren en aromarijke en diverse bovengistingsbieren opvullen.

Naast gewenste fenotypische eigenschappen, erfden gegenereerde interspecifieke gisthybriden doorgaans ook enkele ongewenste eigenschappen van de ouderstammen. Het grotendeel van de nieuwe gisten waren bijvoorbeeld instaat om ferulazuur om te vormen naar 4-vinyl guaiacol, het welke een doorgaans ongewenste kruidnagel-achtige geur en smaak aan bier toevoegt. Om de productie van fenolische ‘off-flavours’ (POF) door de nieuw gegenereerde interspecifieke gisthybriden te onderzoeken, werd er een nieuwe ‘high-throughput’ absorptie-gebaseerde methode ontwikkeld die toelaat om zeer snel het POF-fenotype van honderden gisten in parallel te beoordelen, en dit met een minimum aan werk, ingrediënten of dure apparaten. De ontwikkelde nieuwe metode verhoogde niet enkel het aantal gisten dat in parallel getest kan worden, maar reduceerde ook het bijhorende kostenplaatje significant, alsook vertoonde het een betere accuraatheid in vergelijking met de bestaande ‘State of art’ methodes.

De nieuwe ontwikkelde test werd vervolgens gebruikt, wanneer een ‘CRISPR-Cas9-based gene editing’ strategie geoptimaliseerd en toegepast werd om POF- cisgenetische varianten te creëren van nieuw ontwikkelde en genetisch complexe interspecifieke gisthybriden. Meer precies, werd er een natuurlijk-voorkomende ‘single nucleotide polymorphism’ (SNP) in het ferulazuur decarboxylase-coderend FDC1-gen, het welke gedeeld wordt door de meerderheid van de huidige POF- bovengistingsbiergisten, geselecteerd en geïntroduceerd in het S. eubayanus verkregen FDC1-allel van het interspecifieke hybride genoom met behulp van de geoptimaliseerde ‘CRISPR-cas9-based gene editing’ methode. Vooreerst was dit mogelijk zonder de introductie van voorheen gerapporteerde ‘Loss of Heterozygosity’ of andere vormen van ‘off-target’-activiteit. Daarnaast werden er in uitgevoerde laboschaalfermentatie-testen geen fenotypische bijwerkingen gedetecteerd, wat leidde tot de ontwikkeling van aromatisch diverse maar POF- nieuwe pilsbiergisten.

With an annual worldwide production exceeding 1.96 billion hectolitre, beer is by far the most produced and consumed fermented beverage. More so, it is considered to be the third most consumed beverage worldwide (after water and tea). Traditionally, beer can be divided into two general styles, namely top-fermented (‘ale’) beer and bottom-fermented (‘lager’) beer.

Lager (or Pilsner type) beer accounts for 90% of the total beer production, and is exclusively fermented by Saccharomyces pastorianus. Interestingly, this yeast species is not a clean yeast species, but is rather the result of a cross between the brewing and baker’s yeast S. cerevisiae and a cold tolerant wild yeast, S. eubayanus. The limited genetic diversity of lager yeasts is reflected in the relative limited influence of the yeast on the aroma profile of lager beer, especially when compared to the immense genetic and aromatic diversity of ale S. cerevisiae yeast strains. While the characteristically clean, fresh flavour and aroma of lager beers is one of their most distinctive and praised traits, diversification and differentiation have become increasingly important in today’s market.

The development of new lager hybrids may help generating a set of distinct beers that bridge the gap between diverse, aromatic ales and fresh and drinkable lagers, this without the need to change the standard production process or the need for different and more expensive ingredients.

A spore-to-spore breeding strategy was applied, in order to generate novel interspecific hybrids between six carefully selected S. cerevisiae and two S. eubayanus yeasts. The generated 31 interspecific hybrids were assessed for their temperature tolerance, as well as their fermentation capacity and aroma production in lab scale and (for some) pilot scale lager beer fermentation trials. Overall, generated interspecific hybrids showed a significantly higher growth capacity at low temperatures (4°C-16°C) compared to their respective S. cerevisiae parental strains, combined with a significantly higher growth capacity at high temperatures (30°C and 37°C) compared to their S. eubayanus parental strains. This broadened temperature tolerance of the generated interspecific hybrids not only equips them with a competitive advantage compared to their S. cerevisiae parent in cold temperature driven fermentations. More so, it also shows that generated interspecific hybrids can combine interesting phenotypes of both parental species into one organism. Besides a broadened temperature tolerance, most of the generated interspecific hybrids showed hybrid vigour in terms of their fermentation capacity during lager fermentation trials at 16°C and 12°C, with some interspecific hybrids producing similar ethanol levels compared to our best reference S. pastorianus strains. Aroma production of the generated interspecific hybrids also differed significantly from the commercially used S. pastorianus yeasts, underlying the potential of these novel yeasts for the production of novel beer types, bridging the gap between easy drinkable lager beers and aroma rich and diverse top fermented beers.

Besides only wanted phenotypes, generated interspecific hybrids inherited also some unwanted phenotypes, with the production of phenolic off-flavours (POF) being the most important one. Indeed, the majority of generated interspecific hybrids are POF+, and are able to convert ferulic acid into its decarboxylated product 4 –vinylguaiacol (4VG), introducing often unwanted spicy and clove-like aromas in the fermented product. In order to investigate and remediate this unwanted phenotype of novel interspecific hybrids, we first developed a high-throughput absorbance-based screening tool to quickly assess the POF phenotype of hundreds of yeasts in parallel with only a limited amount of labour, consumables or expensive machines needed. The developed new assay not only increased the throughput and lowered the cost significantly compared to the current state of art, it also showed an increased accuracy in the determination of the POF phenotype of industrial yeasts.

The novel rapid screening method for POF production in yeast was used later on, when a CRISPR-Cas9-based gene editing strategy was developed and applied in order to generate cis-genic POF- variants of novel generated, and genetic complex interspecific hybrid yeasts, increasing their industrial applicability. Specifically, a natural occurring single nucleotide polymorphism (SNP) in the ferulic decarboxylase coding gene FDC1, shared by the vast majority of the current POF- ale beer yeasts, was selected and introduced into the S. eubayanus derived genome of novel interspecific hybrids. Interestingly, the developed CRISPR -Cas9-based gene editing strategy was successful in introducing the selected SNP, without introducing loss of heterozygosity, as reported previously when trying to apply CRISPR -Cas9-based gene editing in genetically complex interspecific hybrid genomes. Besides no observed genetic side effects, no phenotypic side effects were detected, generating aromatic diverse but POF- novel lager yeasts.

Promotor(en)

Prof. K. Verstrepen, Departement Microbiële en moleculaire systemen (M²S).

Leden van de examencommissie

Prof. D. Springael, Departement Aard- en Omgevingswetenschappen, voorzitter.
Prof. B. Lievens, Departement Microbiële en moleculaire systemen (M²S).
Prof. L. De Cooman, Departement Microbiële en moleculaire systemen (M²S).
Prof. V. van Noort, Departement Microbiële en moleculaire systemen (M²S).
Prof. E. Louis, University of Leicester, Adrian Building.

Het proefschrift (1560) ligt ter inzage in de Campusbibliotheek Arenberg, de Croylaan 6, 3001 Heverlee.

Telefoon Promotor(en)

Prof. Kevin Verstrepen, tel.: