Faculteit BIW > Doctorandi > Archief doctoraatsaankondigingen > Doctorandus Elien PEETERS

Elien PEETERS

New delivery strategies for biofilm inhibitors: surface coatings and magnetic nanoparticles as carriers

woensdag 13 december 2017 om 17.30 uur
Jozef Heuts-auditorium, 00.215, Landbouwinstituut, Kasteelpark Arenberg 20, 3001 Heverlee

Wetenschappelijke context van het proefschrift

De laatste jaren is duidelijk geworden dat biofilmen voor grote problemen kunnen zorgen. Het is geweten dat micro-organismen voornamelijk voorkomen als complexe, conditie afhankelijke, oppervlakte geassocieerde gemeenschappen, welke biofilmen genoemd worden. In deze biofilmen zijn micro-organismen ingebed in een zelfgeproduceerde polymere matrix, die bescherming biedt tegen antimicrobiële middelen, zoals antibiotica, ontsmettingsmiddelen en andere stressfactoren. Hierdoor vormen biofilmen zeer persistente besmettingen en infecties, die vaak grote kosten met zich meebrengen en bovendien zeer moeilijk te bestrijden zijn. Bovendien is er een sterke toename in resistentie ontwikkeling tegen de bestaande antibiotica. De nood aan nieuwe strategieën om biofilmen te bestrijden is daarom groter dan ooit. Het doel van dit doctoraatsonderzoek bestaat bijgevolg in het optimaliseren van in-house ontwikkelde 5-aryl-2-aminoimidazool (5-Ar-2-AI) gebaseerde biofilminhibitoren en het ontwikkelen van strategieën voor hun toediening.

Het eerste deel van dit onderzoek richt zich op het bepalen van de antibiofilm activiteit van 5-Ar-2-AI gebaseerde componenten tegen een groot aantal bacteriesoorten en Candida albicans. Hieruit bleek dat de N1-gesubstituteerde 5-Ar-2-AIs actief zijn tegen biofilmen gevormd door Gram-negatieve en Gram-positieve bacteriën en C. albicans, maar toxisch zijn tegen verschillende eukaryote cellijnen. De 2N-gesubstituteerde 5-Ar-2-AIs daarentegen zijn niet toxisch en actief tegen biofilmen gevormd door Gram-negatieve bacteriën en C. albicans, maar zijn in mindere mate actief tegen biofilmen gevormd door Gram-positieve bacteriën. Voor toepassing als nieuwe, antibiofilm coating van orthopedische implantaten werden bovendien de N1,2N-digesubstituteerde 5-Ar-2-AIs ontwikkeld, welke niet toxisch zijn en activiteit vertonen tegen Gram-positieve bacteriën en C. albicans. Verder hebben deze componenten geen effect op de groei van beencellen en wordt de calciumafzetting zelfs geïnduceerd. Veel van deze 5-Ar-2-AIs werken specifiek in op de biofilmvorming, zonder effect op de vrijlevende groei, waardoor de ontwikkeling van bacteriële resistentie verwacht wordt te verminderen.

Het activiteitsspectrum van de N1,2N-digesubstituteerde 5-Ar-2-AIs zorgt ervoor dat deze componenten ideaal zijn voor het coaten van orthopedische implantaten, welke vaak geïnfecteerd worden door Gram-positieve staphylococcen. In een volgend deel werd daarom de in vitro en in vivo activiteit van een N1,2N-digesubstituteerde 5-Ar-2-AI, namelijk LC0024, covalent gecoat op een titanium oppervlak tegen Staphylococcus aureus biofilmen onderzocht. Uit de resultaten bleek dat de gecoate implantaten in beide condities biofilmvorming inhiberen, zonder de vrijlevende groei en de osseointegratie te beïnvloeden. Hiermee wordt het klinisch potentieel van deze antibiofilm coating verder benadrukt.

In een derde deel van dit onderzoek werd getracht de toepasbaarheid van de 5-Ar-2-AIs te verhogen door middel van covalente koppeling aan magnetische ijzeroxide nanopartikels. Evaluatie van hun activiteit tegen een breed spectrum aan bacteriële soorten toonde aan dat de biofilm-specificiteit, dit is de activiteit tegen de biofilm zonder effect op de vrijlevende groei, verhoogd werd in vergelijking met de 5-Ar-2-AIs in oplossing. Bovendien zorgt de koppeling aan magnetische nanopartikels voor een aantal extra inhibitiemogelijkheden door gebruik te maken van een magnetisch veld, zoals een verhoogde biofilmpenetratie en opwarming van de nanopartikels.

In een laatste deel werden de 5-Ar-2-AIs gevalideerd in een multispecies biofilm model dat werd opgesteld op basis van in situ staalnames in irrigatieleidingen van vier serres, waar biofilmvorming voor grote problemen zorgt. Uit de resultaten van de staalnames bleek inderdaad dat de huidige desinfectiemethode onvoldoende is om de microbiële contaminaties te verwijderen. Het bepalen van de activiteit van de 5-Ar-2-AIs, vrij in oplossing evenals gebonden aan de magnetische nanopartikels, tegen een multispecies biofilm model toonde aan dat de vrije 5-Ar-2-AIs zeer actief zijn tegen alle bacteriesoorten in de biofilm terwijl de ijzeroxide nanopartikels en de 5-Ar-2-AI-gefunctionaliseerde ijzeroxide nanopartikels slechts actief zijn tegen een aantal bacteriesoorten in de biofilm. Door het bepalen van de inter-species interacties in de multispecies biofilmen, bleek dat er vooral competitieve interacties aanwezig zijn, waarbij tenminste één species een negatief effect ondervond door de aanwezigheid van de andere species. Verder werd na toediening van de nanopartikels een verhoogde tolerantie vastgesteld in de multispecies biofilm, in vergelijking met de monospecies biofilmen. Deze verhoging kon verklaard worden door een vermindering van de competitieve interacties en bijgevolg een heropleving van de onderdrukte soorten. Een andere optie kan zijn dat de aanwezigheid van een concurrerende soort rechtstreeks de inherente tolerantie van een andere soort verhoogt.

Samengevat werden met dit onderzoek twee nieuwe toepassingen van de 5-Ar-2-AIs uitgewerkt. Het therapeutisch potentieel van de 5-Ar-2-AIs werd bevestigd door het coaten van een titanium oppervlak, en hun toediening werd verbeterd door het covalent koppelen aan magnetische nanopartikels. Bovendien werd de industriële relevantie verhoogd door gebruik te maken van multispecies irrigatie biofilm modellen.

Over the years, the problems associated with biofilm formation have become more and more clear. It is known that microorganisms mainly occur as complex, condition-dependent, surface-associated communities, called biofilms. Within these biofilms the microorganisms are embedded in a self-produced polymeric matrix, which offers protection against antimicrobials, such as antibiotics, disinfectants and other stress factors. As a result, biofilms form highly persistent contaminations and infections, which are associated with high economical costs and are moreover very difficult to remove. In addition, a strong increase in resistance development against the existing antibiotics is observed. Consequently, the need for new antibiofilm strategies is higher than ever. The goal of this PhD research is therefore to optimize in-house developed biofilm inhibitors with a 5-aryl-2-aminoimidazole (5-Ar-2-AI) scaffold and to develop strategies for their delivery.

The first part of this research aims at determining the antibiofilm activity of 5-Ar-2-AI-based compounds against a panel of bacterial species and Candida albicans. The results showed that the N1-substituted 5-Ar-2-AIs are active against biofilms formed by Gram-negative and Gram-positive bacteria and C. albicans, but are toxic against various eukaryotic cell lines. In contrast, the 2N-substituted compounds are nontoxic and active against biofilms formed by Gram-negative bacteria and C. albicans, but have reduced activity against biofilms formed by Gram-positive bacteria. In an attempt to develop a new antibiofilm coating on orthopedic implants, the N1,2N-disubstituted 5-Ar-2-AIs were generated which are nontoxic and active against Gram-positive bacteria and C. albicans. Moreover, these compounds do not affect the viability of bone cells and even induce calcium deposition. Many of the 5-Ar-2-AI-based compounds specifically interfere with biofilm formation without affecting the planktonic growth, whereby bacterial resistance development is expected to be reduced.

The activity spectrum of the N1,2N-disubstituted 5-Ar-2-AIs makes these compounds ideal candidates for coating on orthopedic implants, since these implants are very susceptible for biofilm infections by Gram-positive staphylococci. Consequently, in a next part the in vitro and in vivo activity of a 5-Ar-2-AI-based compound, designated as LC0024, covalently bound to a titanium implant surface, was evaluated against Staphylococcus aureus biofilms. The results showed that the coated implants inhibit biofilm formation under both conditions, without affecting the planktonic growth and the osseointegration potential. Hereby, the clinical potential of this antibiofilm coating is further highlighted.

In a third part of this research, it was attempted to increase the applicability of the 5-Ar-2-AIs by covalent attachment to magnetic iron oxide nanoparticles. Evaluation of their antibiofilm activity against a broad panel of bacterial species showed a drastic increase in biofilm-specificity, i.e. activity against the biofilm without affecting the planktonic growth, as compared to the 5-Ar-2-AIs in solution. Furthermore, the addition of magnetic nanoparticles to the 5-Ar-2-AIs was shown to offer a number of extra inhibitory possibilities by making use of magnetic forces, for example, increased biofilm penetration and magnetic particle heating.

In a final part, the 5-Ar-2-AIs were validated against a multispecies biofilm model that was constructed based on in situ samples taken from irrigation systems in four greenhouses, where biofilm formation causes many problems. Analysis of a large number of samples indeed showed that the currently used disinfection strategy is not sufficient to remove microbial contaminations. Evaluation of the activity of the 5-Ar-2-AIs, free in solution as well as covalently bound to iron oxide nanoparticles, against a multispecies biofilm model, showed that the free 5-Ar-2-AIs are very active against all species in the multispecies biofilm, whereas the iron oxide nanoparticles and the functionalized nanoparticles are only active against certain species in the biofilm. Determination of the inter-species interactions in the multispecies biofilms showed dominance of competitive interactions, in which at least one species experiences a negative effect from the presence of the other species. Furthermore, upon treatment with the magnetic nanoparticles an elevated tolerance was found in the multispecies biofilm compared to the monospecies biofilms. This increase in tolerance could be attributed to a reduction of the competitive interactions, resulting in an elevated growth of the suppressed species. Next to changes in inter-species interactions, the presence of a competing species could directly enhance the inherent tolerance of other species.

In summary, this research led to the generation of two new application strategies of the 5-Ar-2-AIs. The therapeutic potential of the 5-Ar-2-AIs was confirmed by the covalent coating of a titanium surface, and their delivery was enhanced by covalent attachment to magnetic nanoparticles. Moreover, the industrial relevance was increased by using multispecies irrigation biofilm models.

Promotor(en)

Prof. H. Steenackers, Departement Microbiële en moleculaire systemen (M²S).
Prof. J. Vanderleyden, Departement Microbiële en moleculaire systemen (M²S).

Leden van de examencommissie

Prof. H. Ramon, Departement Biosystemen (BIOSYST), voorzitter.
Prof. P. Van Dijck, Departement Biologie.
Prof. I. Vankelecom, Departement Microbiële en moleculaire systemen (M²S).
Prof. T. Verbiest, Departement Chemie.
Prof. E. Van der Eycken, Departement Chemie.
Ir. L. Wittemans, Proefstation voor de Groenteteel.

Het proefschrift (1478) ligt ter inzage in de Campusbibliotheek Arenberg, de Croylaan 6, 3001 Heverlee.

Telefoon Promotor(en)

Prof. Hans Steenackers, tel.: +32 16 37 95 19
Prof. Jozef Vanderleyden, tel.: +32 16 329679