Faculteit BIW > Doctorandi > Archief doctoraatsaankondigingen > Doctorandus Toon SWINGS

Toon SWINGS

Identification and optimization of ethanol tolerance mechanisms in Escherichia coli by means of experimental evolution

donderdag 24 augustus 2017 om 16.30 uur
aula Arenbergkasteel, 01.07, Kasteelpark Arenberg 1, 3001 Heverlee

Wetenschappelijke context van het proefschrift

De fossiele brandstofreserves blijven slinken terwijl de vraag naar energie steeds groter wordt. Daarom wordt het oplossen van het energievraagstuk één van de grootste uitdagingen voor de mensheid in de 21ste eeuw. De afgelopen jaren werd reeds veel tijd en moeite gestoken in het vergemakkelijken van de overgang van fossiele brandstof naar hernieuwbare bio-brandstof. Vooral bio-ethanol kreeg veel aandacht en het gebruik hiervan is momenteel reeds goed geïntegreerd in onze maatschappij. Deze ethanol wordt geproduceerd in een fermentatieproces door micro-organismen, zoals gist en Escherichia coli, die suiker omzetten in alcohol. Het grootste obstakel hierbij is de toxiciteit van ethanol. Wanneer een organisme ethanol produceert, wordt het ook blootgesteld aan steeds hogere concentraties waardoor de productie uiteindelijk stilvalt. Daarom is het begrijpen en verhogen van ethanoltolerantie enorm belangrijk om het productieproces te optimaliseren en de prijs van bio-ethanol te verlagen zodat het de concurrentie kan aangaan met fossiele brandstoffen. Ondanks het belang van ethanoltolerantie, blijft dit fenotype toch weinig begrepen in E. coli. Daarom lag de focus van dit werk op verschillende aspecten van ethanoltolerantie in E. coli, gaande van de evolutionaire processen onderliggend aan adaptatie aan hoge ethanolconcentraties tot de genetische basis van ethanoltolerantie en het fysiologisch effect van ethanol op E. coli.

Ethanoltolerantie is een complex fenotype dat meerdere mutaties vereist aangezien het bepaald wordt door een netwerk van genen die met elkaar interageren. Bovendien is ethanol toxisch voor E. coli waardoor blootstelling kan leiden tot het afsterven van de cel. Om ethanoltolerantie te bestuderen gebruikten we experimentele evolutie. Dit werk levert voor het eerst inzicht in de evolutionaire dynamiek die aan de basis ligt van adaptatie aan zeer hoge ethanolconcentraties. Verrassend genoeg bleek dat enkel lijnen met een verhoogde mutatiesnelheid in staat waren te evolueren naar hoge ethanoltolerantie (tot 8.5%). Bovendien tonen we aan dat een hoge mutatiesnelheid ervoor zorgt dat er voldoende genetische variatie in de populatie optreedt om adaptatie op korte termijn mogelijk te maken en zo uitsterven te vermijden. We observeerden ook een opvallend grote flexibiliteit in de mutatiesnelheid van de populatie tijdens adaptatie aan steeds toenemende ethanolconcentraties. Specifiek steeg de mutatiesnelheid bij blootstelling aan hogere ethanolconcentraties en daalde de mutatiesnelheid wanneer de populatie aangepast was aan die concentratie. Dit steeds op- en neergaan van de mutatiesnelheid werd meerdere opeenvolgende keren waargenomen, wat wijst op een enorm genetisch potentieel in E. coli voor het aanpassen van de mutatiesnelheid. Daarenboven konden we de mortaliteit als onderliggende drijvende kracht van de veranderingen in mutatiegraad identificeren. De bevindingen uit dit hoofdstuk werpen een nieuw licht op evolutie in stressvolle condities en kunnen ze implicaties hebben voor andere relevante situaties zoals bacteriën die blootgesteld worden aan lethale antibiotica of kankercellen die behandeld worden met chemotherapie. In deze gevallen kan hypermutatie een uitweg bieden om zulke condities te overleven. Daarom zou het laag houden van de mutatiegraad een bijkomend objectief kunnen zijn om in de toekomst antibioticumresistentie en herval van kanker te verminderen.

Hoewel een verhoogde mutatiesnelheid nodig bleek om sterk ethanoltolerante stammen te bekomen, zorgde dit ook voor een veel hogere complexiteit van de sequentiedatasets van deze stammen. Daarom hebben we IAMBEE (Identificatie van Adaptieve Mutaties in Bacteriële Evolutie Experimenten) ontwikkeld. Deze tool maakt gebruik van het verschil in frequentie van een mutatie voor en na een sterke fenotypisch verandering en een score die de impact van de mutatie op eiwitniveau weergeeft. Beide parameters worden vervolgens in een netwerkanalyse gebruikt om reactiepaden te identificeren waarin mutaties verhoogde ethanoltolerantie kunnen veroorzaken. Op deze manier konden we onder andere veranderingen in vetzuursamenstellingen en veranderingen in multidrug effluxpompen identificeren en hun rol bevestigen. Daarnaast bleek ook verhoogde transcriptie- en translatiebetrouwbaarheid belangrijk te zijn. De geïdentificeerde doelwitten kunnen in de toekomst dienen als basis voor het optimaliseren van productieorganismen. Om de geïdentificeerde mutaties verder te onderzoeken, werden enkele hiervan reeds enkelvoudig aangebracht in de wildtype stam door middel van een eigen ontwikkelde genoom modificatie methode.

Ten slotte werden verschillende componenten van ethanol-geïnduceerde mutagenese geïdentificeerd. Ethanol zorgt hierbij voor oxidatieve stress, al dan niet via lipideperoxidatie. De reactieve zuurstof species veroorzaken DNA schade, wat op zijn beurt de SOS-respons activeert en zorgt voor overexpressie van error-prone polymerases die de DNA schade mutageen herstellen. Er moeten echter nog experimenten uitgevoerd worden om dit systeem volledig te begrijpen.

Dit doctoraat draagt bij tot het begrijpen van adaptatie in extreem stressvolle omgevingen, wat op termijn kan leiden tot de ontwikkeling van anti-evolutie therapieën en een snelle methode voor het genereren van gewenste fenotypes. IAMBEE is toepasbaar op andere complexe datasets en de CRISPR-gebaseerde methode is bruikbaar voor andere onderzoekers die werken op E. coli maar ook voor het ontwikkelen van een gelijkaardige strategie voor andere organismen. Tot slot kunnen de geïdentificeerde mutaties dienen als basis voor het verder optimaliseren van een ideaal productieorganisme voor de bio-ethanolindustrie.

Fossil fuel reserves are declining while energy demands continue to increase. Therefore, solving the energy issue poses one of the greatest challenges of the 21st century. Over the past decades, multiple efforts have been undertaken to facilitate the switch from fossil fuels to renewable biofuels. Especially bioethanol has gained much attention. It is one of the biofuels that is already widely integrated in our society. Ethanol is produced in microbial fermentation processes by microorganisms such as yeast or Escherichia coli that convert sugar into ethanol. However, one of the major obstacles in obtaining high yields is the toxicity of ethanol itself. When production proceeds and ethanol titers rise, further production of ethanol is gradually inhibited. Therefore, understanding and increasing ethanol tolerance in ethanol-producing organisms is needed to further improve the production process and increase the competitiveness of bioethanol over fossil fuels. Despite its industrial relevance, ethanol tolerance in E. coli remains poorly understood. Therefore, this work focuses on several aspects of ethanol tolerance in E. coli ranging from the evolutionary dynamics driving adaptation to high ethanol stress to the genetic architecture underlying high ethanol tolerance and the physiological effects of ethanol on E. coli.

Ethanol tolerance is a complex phenotype which requires multiple mutations as it is established by a network of cooperating genes and pathways. Moreover, ethanol is highly toxic for E. coli imposing near-lethal stress conditions. To study ethanol tolerance we exploited the power of experimental evolution and natural selection. Our work provides the first insight into the evolutionary dynamics underlying adaptation to such complex and near-lethal stress conditions. Surprisingly, we found that only lines with an increased mutation rate are able to acquire high ethanol tolerance (up to 8.5%). Moreover we found evidence that hypermutation rapidly provides enough genetic variation in the population under stress to enable adaptation and avoid extinction. Strikingly, we discovered an enormous flexibility in the mutation rate of populations adapting to increasing ethanol percentages. Specifically, mutation rates rise when exposed to increased ethanol stress and decline again once the population is adapted to that percentage. This cycle of increase and decrease in mutation rate was observed multiple times showing an enormous genetic potential to adapt the mutation rate in E. coli. In addition, we identified cellular mortality as the driving force underlying these quick changes in the mutation rate. Taken together, our findings shed new light on the evolutionary dynamics under stress. Moreover, they can have implication in other relevant situations as well such as cells exposed to antibiotics or cancer cells treated with chemotherapy. Hypermutation provides a way to survive these lethal conditions and must therefore be considered in future therapy strategies.

While hypermutation was essential to obtain high ethanol tolerant strains, it also severely increased the complexity of the mutational dataset resulting from sequencing these lines. To cope with this complexity, we developed IAMBEE (Identification of Adaptive Mutations in Bacterial Evolution Experiments). This tool uses both the change in frequency of mutations during a selective sweep that corresponds to a significant phenotypic change and a score that reflects the effect of the mutation at the protein level in a network analysis to prioritize pathways that are involved in the phenotype. Using this tool we identified and confirmed the role of various pathways in high ethanol tolerance. For example, changes in fatty acid biosynthesis and changes in multi-drug efflux pump as well as changes in transcription and translation fidelity are causal for increased ethanol tolerance. The results of this part of our work could serve as a basis for future strain improvement efforts. To fully understand the mechanistic implications of the identified mutations in ethanol tolerance, we already reconstructed them in a clean background with an in-house developed scarless genome engineering method.

Finally, we identified several components underlying ethanol-induced mutagenesis. More specifically, ethanol induces oxidative stress, possibly by lipid peroxidation. The reactive oxygen species react with the DNA and result in lesions that in turn activate the SOS-response. This leads to overexpression of SOS-inducible error-prone polymerases that mutagenically repair damage in the DNA, resulting in mutations. More experiments are needed to confirm this mechanism, but these results might have implication for ethanol consumption in beverages and related health implications.

In conclusion, this thesis contributes to the understanding of adaptation to extreme stress conditions, which might lead to the development of anti-evolution therapy strategies and the development of fast strain optimization methods based on hypermutation. IAMBEE is applicable for other complex mutational datasets as well and our CRISPR-based method might be extremely useful for others working with E. coli and even with different organisms for which a similar approach can be applied. Finally, the identified mutations might serve as a basis for further strain improvements for the bioethanol industry.

Promotor(en)

Prof. J. Michiels, Departement Microbiële en moleculaire systemen (M²S).
Dr. N. Verstraeten, Departement Microbiële en moleculaire systemen (M²S).

Leden van de examencommissie

Prof. H. Ramon, Departement Biosystemen (BIOSYST), voorzitter.
Prof. K. Marchal, Departement Microbiële en moleculaire systemen (M²S).
Prof. J. Thevelein, Departement Biologie.
Prof. K. Verstrepen, Departement Microbiële en moleculaire systemen (M²S).
Prof. C. Marx, University of Idaho.

Het proefschrift (1434) ligt ter inzage in de Campusbibliotheek Arenberg, de Croylaan 6, 3001 Heverlee.

Telefoon Promotor(en)

Prof. Jan Michiels, tel.: +32 16 329684
Dr. Natalie Verstraeten, tel.: +32 16 37 66 43