Via genetische transformatie kan een gen of een set van genen ingebracht worden in het genoom van een cel. Deze cel kan daarna opgekweekt worden om zich te ontwikkelen tot een transgene plant. In 1989 werden de eerste transgene appelplanten geproduceerd met behulp van de bacterie Agrobacterium tumefaciens. Gedurende de daaropvolgende jaren hebben tal van onderzoekers – ook aan het Fruitteeltcentrum – bijgedragen tot de ontwikkeling van transformatieprotocols voor appel. Aan het Fruitteeltcentrum werden transformaties bij appel uitgevoerd voor het bekomen van ziekteresistentie en het opheffen van zelf-incompatibiliteit.

In dit project willen we het transformatieprotocol verder optimaliseren en toepasbaar maken voor verschillende cultivars. Ook wordt de mogelijkheid onderzocht om het fosfomannose isomerase (PMI)-gen te gebruiken bij appel als alternatief voor de nptII-selectiemerker.

Agrobacterium tumefaciens-gemedieerd transformatieprotocol voor appel

Het transformatie-protocol dat gebruikt wordt aan het Fruitteeltcentrum maakt gebruik van de bacterie Agrobacterium tumefaciens. Blaadjes van in vitro appelplanten (figuur 1) worden met drie transversale sneetjes verwond en in een Agrobacterium-suspensie gedompeld. Hierna worden de blaadjes 4 dagen gecocultiveerd met Agrobacterium.

Figuur 1 : In vitro appelplanten, uitgangsmateriaal voor Agrobacterium transformaties

In die tijd kan de bacterie de verwonde blaadjes infecteren en brengt hij een stuk van zijn DNA – het T-DNA – in de plantencel. In het T-DNA bevindt zich het gen voor selectie en eventueel een reportergen voor detectie van transgene cellen en/of de genen die coderen voor de agronome kenmerken die we willen inbrengen zoals ziekteresistentie. Na 4 dagen cocultivatie worden de blaadjes gespoeld met antibiotica om Agrobacterium te verwijderen en worden ze geplaatst op een regeneratiemedium met antibiotica (figuur 2).

Figuur 2 : Verwonde blaadjes na cocultivatie met Agrobacterium, op regeneratiemedium.

Tijdens de periode op het regeneratiemedium integreert het T-DNA zich in het genoom van de plantencel. Enkel de getransformeerde cellen zullen op het selectiemedium in staat zijn te regenereren (figuur 3).

Eerst wordt callus (d.i. gededifferentieerd weefsel) gevormd waarna op deze callus scheutvorming optreedt. Scheutjes die op deze manier gevormd werden, worden op strekkingsmedium geplaatst en vermenigvuldigd. Om na te gaan of de bekomen scheutjes werkelijk transgeen zijn, worden ze geanalyseerd met PCR en/of een histochemische GUS-kleuring (figuur 4).

Figuur 4 : Gus-kleuring van scheutjes geregenereerd uit geďnoculeerde appelbladeren. Links een Gus-positieve (getransformeerde) scheut, rechts een ongetransformeerde scheut.

Een inoculatie met Agrobacterium resulteert in de inbreng van T-DNA in het plantgenoom van geďnfecteerde cellen. Toch is na behandeling met Agrobacterium het aandeel getransformeerde cellen per blaadje nog steeds veel lager dan het aantal niet-getransformeerde cellen. Daarom voegt men in het T-DNA een gen voor selectie toe. Enkel cellen die getransformeerd zijn en dus het selectiegen in zich dragen kunnen regenereren.

Het meest gebruikte selectiegen bij appel en andere gewassen is het nptII-gen dat codeert voor neofosfotransferase. Dit proteďne is in staat aminoglycoside-antibiotica zoals kanamycine te inactiveren. Niet transgene cellen worden afgedood door het selectief agens kanamycine terwijl de getransformeerde cellen het antibioticum kunnen inactiveren, erop kunnen groeien en regenereren. Het nadeel van dit selectie-systeem is echter dat de niet-transgene cellen afgedood worden. De afgedode cellen produceren componenten die negatief zijn voor de ontwikkeling van de transgene cellen. Tevens ligt het gebruik van een gen dat resistent maakt tegen antibiotica moeilijk bij het publiek. Om deze redenen is het zinvol te zoeken naar een ander selectiesysteem.

Recent werd een nieuw selectiesysteem geďntroduceerd. Plantcellen worden getransformeerd met het fosfomannose-isomerase (PMI)-gen dat codeert voor een enzyme dat mannose-6-P omzet in fructose-6-P. Mannose-6-P kan door de meeste plantspecies niet gebruikt worden als koolstofbron. Cellen getransformeerd met het PMI-gen zetten de mannose-6-P om in een product dat ze wel kunnen assimileren nl. fructose-6-P. De niet getransformeerde cellen worden dus niet afgedood, maar kunnen niet groeien en regenereren op een medium met mannose.

Binnen het kader van dit project werd aangetoond dat mannose ook door appel niet als koolstofbron kan gebruikt worden. In vitro appel plantjes stoppen met groeien en multipliceren wanneer zij op een voedingsbodem worden geplaatst met mannose, zelfs bij zeer lage concentraties en indien tevens sucrose in het medium aanwezig was. Transgene appelplanten die het PMI-gen bevatten, vertoonden een normale ontwikkeling op mannose-medium, ook wanneer er geen sucrose als bijkomende koolstofbron aanwezig was. Regeneratie van bladexplantaten werd verhinderd op mannose-concentraties vanaf 5 g/l. Transformaties gebruik makende van het mannose selectie systeem hebben tot nu toe geresulteerd in enkele transgene lijnen. De efficiëntie ligt echter tot nu toe nog lager dan voor nptII selectie. Verdere optimalisatie van het systeem is noodzakelijk.