Project

1. Inleiding

Bij de productie van appel kunnen na de oogst nog zeer grote verliezen optreden, die hoofdzakelijk veroorzaakt worden door schimmelziekten. De controle van deze bewaarschimmels gebeurt hoofdzakelijk door toepassing van chemische bestrijdingsmiddelen vlak voor en/of na de oogst. Er is echter nood aan alternatieve bestrijdingsmethoden omdat sommige bewaarschimmels resistentie ontwikkeld hebben tegen fungiciden met een specifieke werking en bovendien vraagt de consument naar een residuvrij product.

Via moleculaire veredeling kan een natuurlijke resisentie opgebouwd worden in de appel die bescherming biedt tegen aantasting door schimmels. Aan het Fruitteeltcentrum werd de appelcultivar Jonagold getransformeerd met genen coderend voor antimicrobiële peptiden (AMP’s). Deze AMP’s vertonen in vitro een sterke werking tegen verschillende schimmels, waaronder ook bewaarschimmels. In dit project wordt onderzocht of de AMP’s ook in vivo, in een appel, een bescherming kunnen bieden tegen bewaarschimmels. Er wordt gewerkt met drie verschillende AMP’s: Ah-AMP (geïsoleerd uit Paardekastanje), Ace-AMP (geïsoleerd uit ajuin) en Rs-AMP (geïsoleerd uit Radijs).

 

2. Moleculaire karakterisatie van de AMP-lijnen

 

De moleculaire karakterisatie van de AMP-lijnen bestaat uit de meting van de expressie van de AMP’s in appel en de studie van het integratiepatroon van het transgen.

Er werd een protocol op punt gesteld voor de eiwitextractie uit blad- en vruchtweefsel, vervolgens werd de ELISA-techniek voor het meten van de expressie van de AMP’s op punt gesteld en toegepast op de verschillende transgene lijnen. De resultaten van de AMP-expressie in bladmateriaal is weergegeven voor de verschillende Rs- AMP-lijnen.

 

lijn	staal	# ng Ah-AMP/ml verhit extract	# µg proteïne / ml ruw extract	% expressie
31	a	264	3817	0.0069
	b	165	3926	0.0042
32	a	388	3029	0.0128
	b	642	4194	0.0153
33	a	163	5753	0.0028
	b	191	3554	0.0054
34	a	466	4004	0.0116
	b	550	2702	0.0204
53	a	422	5550	0.0076
	b	423	3759	0.0112
57	a	343	5382	0.0064
	b	94	3579	0.0026
63	a	59	3129	0.0019
	b	38	2854	0.0013
64	a	11	1260	0.0009
	b	11	2469	0.0005
controle	a	7	2389	0.0003
	b	9	2127	0.0004

Het integratiepatroon wordt bestudeerd met de Southern blot techniek. Met deze techiek kan het aantal inserties en het aantal kopijen van het transgen bepaald worden. Voor een groot aantal lijnen kon worden aangetoond dat er meerdere kopijen van het transgen geïnsereerd zijn. Dit zou de variabele en eerder lage expressie van de AMP’s (zie tabel) gedeeltelijk kunnen verklaren.

 

3. Studie van de variabiliteit in expressieniveau bij transgene GUS-planten van appel

 

De resultaten van de ELISA-testen hebben een sterk variabele AMP-expressie aangetoond tussen twee stalen van eenzelfde transgene lijn (zie tabel). Daarom zal in dit project ook getracht worden een inzicht te krijgen in de variabiliteit in transgenexpressie door onderzoek op verschillende transgene GUS-lijnen van appel. Er zullen MUG-analyses (meting van de GUS-expressie), Northern blots en GUS-kleuringen uitgevoerd worden bij verschillende trangene GUS-lijnen in verschillende ontwikkelingsstadia van de appelplant. Ook het integratiepatroon van de GUS-lijnen zal grondig onderzocht worden zodat een verband kan gezocht worden tussen het integratiepatroo, het expressieniveau en de stabiliteit van expressie van transgenen.

 

4. Infectietesten met Botrytis cinerea, Nectria galligena en Monilia fructigena

De resistentie van de transgene vruchten wordt bepaald via artificiële infectietesten met bewaarschimmels. Tot hiertoe werden infectietesten uitgevoerd met Botrytis cinerea. Vanaf dag 4 tot en met dag 11 na inoculatie wordt dagelijks de diameter van de symptomen (rond 3 aangebrachte wonden) gemeten. Voor alle appels wordt op elk moment de som van de diameters genomen, vervolgens wordt voor elke transgene lijn een gemiddelde genomen van de infectiegraad over de verschillende appels. Op deze manier krijg je een gemiddelde infectiegraad in functie van de tijd voor de verschillende transgene lijnen. In de figuur worden de resultaten weergegeven voor de verschillende transgene lijnen getransformeerd met het Ace-AMP. De gemiddelde infectiegraad van de lijnen 35 en 43 is vanaf dag 6 na inoculatie significant lager als de gemiddelde infectiegraad van de controle. In de toekomst zullen nog infectietesten uitgevoerd worden met andere bewaarschimmels, namelijk met Nectria galligena en Monilia fructigena.